尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG 酶）說明書
Uracil-N-Glycosylase
Cat. No. K0951
保存：-20℃
組分說明
Cat.No. K0951 K0951A
KitSize 200U 5×200U
Uracil-N-Glycosylase，1U/μl 200 μl 5×200 μl
產(chǎn)品簡介
尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）也稱為尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），通過大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶，該蛋白分子量為25kD，可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶，并且對RNA無活性，主要應(yīng)用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。該酶作用機(jī)理為：在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP，擴(kuò)增產(chǎn)物片段中的T全部被U取代，形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解反應(yīng)體系中含U的DNA，有效消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，大大降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性，從而保證擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性。
單位定義
37℃，60分鐘內(nèi)催化1nmol尿嘧啶，從含尿嘧啶的DNA上釋放所需要的酶量定義為一個(gè)單位。
質(zhì)量控制
SDS-PAGE檢測純度大于95%；經(jīng)檢測無核酸內(nèi)、外切酶活性。
注意事項(xiàng)
1. UNG長期儲(chǔ)存(非頻繁使用; 每月少于3次)請置于-70℃保存，每天或每周使用請于-20℃保存。盡量避免反復(fù)凍融，大包裝建議分裝使用。
2.UNG可以在PCR反應(yīng)前先清除不慎污染的U-DNA分子，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須在所有的PCR反應(yīng)中使用dUTP作為dNTP之 一，使所有擴(kuò)增產(chǎn)物都成為U-DNA。如單使用于某個(gè)檢測，T-DNA仍會(huì)積累，此抗污染系統(tǒng)也難以起到*的作用。
3. UNG/dUTP系統(tǒng)是PCR試劑內(nèi)部的一種防污染措施，為了防止PCR產(chǎn)物的污染，尤其是在臨檢實(shí)驗(yàn)室中反復(fù)放大同一片段時(shí)，必須嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)室的分劃和操作。
使用方法
以下舉例為常規(guī)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。
1. PCR反應(yīng)體系：
試劑 50μl反應(yīng)體系 終濃度
TaqPCRBuffer，10× 5μl 1×
dATP，10mM 1μl 200μM
dGTP，10mM 1μl 200μM
dCTP，10mM 1μl 200μM
dTTP，10mM 0.5 μl 100μM
dUTP，10mM 1μl 200μM
ForwardPrimer，10μM 1μl 0.2μM
ReversePrimer，10μM 1μl 0.2μM
TemplateDNA Xμl
，
TaqDNAPolymerase 5U/μl 0.5μl
Uracil-N-Glycosylase， 1U/μl 0.2μl
RNase-FreeWater upto50 μl
注意：TaqDNAPolymerase與Uracil-N-Glycosylase的反應(yīng)緩沖液和酶儲(chǔ)存液可以通用。
2. PCR 反應(yīng)條件：
步驟 溫度 時(shí)間
UNG消化 37℃-50℃ 5-10min
預(yù)變性 95℃ 10min
變性 94℃ 30s
退火 55-65℃ 30s 30-40 個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 1min
延伸
注意：通常將Taq酶與UNG酶按一定的比例加入終PCR反應(yīng)體系中，先于72℃37℃-50℃范圍內(nèi)消化 5min5-10分鐘，然后95℃10分鐘滅活，（同時(shí)這一步也達(dá)到預(yù)變性和熱啟動(dòng)的效果），隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。UNG酶的反應(yīng)可以在37℃-50℃，5-10分鐘的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行調(diào)整。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：
