無血清傳代培養(yǎng)
黏附因子:如果除掉血清,就必須直接在培養(yǎng)基中加入25-50ug/ml的粘連蛋白或1-5ug/ml的層粘連蛋白用以處理塑料培養(yǎng)器皿的生長表面.用1mg/ml的多聚L-融賴氨酸預(yù)處理塑料培養(yǎng)器皿,可增強(qiáng)人類二倍體成纖維細(xì)胞的存活率.
蛋白酶抑制劑:利用胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)后,加入血清可抑制剩余的蛋白水解酶的活性,所以用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)必須在無血清培養(yǎng)基中加入如大豆胰蛋白酶抑制劑或0.1mg/ml的牛胰蛋白酶抑制劑等蛋白酶抑制劑.由于粗制胰蛋白酶是由多種蛋白酶組成的復(fù)雜的混合物,其中不同的成分需要不同的抑制劑,因而建議用純的胰蛋白酶及其對應(yīng)的胰蛋白酶抑制劑.否則就要用離心的方法洗滌細(xì)胞以去除胰蛋白酶.在無血清條件下鏈蛋白酶有可能通過被稀釋而失活,不存在一系列的中和作用.
胰蛋白酶和其他蛋白酶:用胰蛋白酶處理無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí),需要特別注意,因?yàn)榧?xì)胞易碎,可能需要使用純化的結(jié)晶胰蛋白酶以及降低胰蛋白酶的溫度以減少細(xì)胞的損傷.選擇蛋白酶的種類可以避免動(dòng)物蛋白來源的物質(zhì)存留于細(xì)胞.用重組的胰蛋白酶可代替提純的prorcine.非哺乳動(dòng)物蛋白酶也可選用蛋白酶.解離酶,膠原酶是細(xì)菌的蛋白酶,不能用胰酶抑制劑使其失活,可能需要用離心的方法去除.在沒有使酶失活的無血清條件下,可以用稀釋的方法使Pronase失活.蛋白酶是非常有效的,但對一些細(xì)胞有毒性.如果有上皮細(xì)胞存在,用Dispase和膠原酶消化時(shí),不能得到單細(xì)胞懸液.
